自去年我们介绍了《美天旎（miltenyi）**磁珠细胞分选过程中常见的问题》以来，受到大量细胞分选用户的关注和好评，为此，我们将近期广大用户咨询或了遇到的问题总结为美天旎（miltenyi）**磁珠细胞分选常见问题（二），以飨读者。同时我们，欢迎大家通过佰乐良成网站（www.bio-launching.com）和官方新浪微博（http://e.weibo.com/bjbllc/）进行提问。
1、 对细胞进行磁珠分选后，所要分选的目的细胞的阳性比率没有变化或变化不大，为什么？
答：可能是抗体或protocol两方面原因。
2、 很多文献报道的磁珠分选和流式分选后细胞的活力是没有差别的，不知数据是否合理？
答：一般来说，较好的磁珠分选和流式分选后细胞的活力是没有差别的。
3、 磁珠分选所使用的磁珠相与流式分选所学抗体那个更经济？
答：单从价格角度看肯定是使用流式分选更经济，因为流式分选所用的抗体也比磁珠便宜。但我们还需要考虑到价格以外的其他因素，比如分选速度、实验室条件是否能达到流式的无菌分选的要求等。
4、 美天旎的磁珠分选出来的细胞能直接做流式检测吗？
答：可以直接做流式检测。
因为1、miltenyi的磁珠直径只有50nm，比细胞小很多很多，不会影响细胞的光散射特性；另外，磁珠上没有荧光标记，所以也不会影响流式中荧光的激发。2、miltenyi的磁珠分选中，要通过分选柱将磁场扩大1000倍，因此分选时只需很少的磁珠标记上即可将细胞留在磁场中。其实磁性标记只占用细胞表面抗原的20－30％的结合位点，不影响后面流式抗体再去结合细胞的。同时英爱根据细胞表达强弱来选择流抗：一般情况下，细胞表达较强，磁珠占据抗原表位的20-50%左右（如2000个分子中占500个）剩下的50%以上的位点还可以结合流抗，这种情况用同一个克隆号的检测抗体就能检测到我们的目标marker的表达；但对于表达水平较弱（CD133，CD25，人CD117等）的marker，磁珠占据大部分位点，同一个克隆号的抗体无法再与同一个表位结合，只能选择不同表位的流抗才能检测到。针对biotin偶联抗体的间标分选，我们也可以选择偶联荧光素的抗生物素抗体检测，如CD25-biotin也可以用biotin-PE/APC检测。对于这种弱表达的情况，建议大家选择抗体*好是PE等强荧光素偶联的。
5、 美天旎的磁珠与Dynal的分选器可以配套使用吗？
答：不可以相互替换使用。因为Dynal的分选磁珠体积较大，*小的也在直径1um，这种大体积的磁珠可以与磁场直接作用，但对细胞损伤大，而且容易在分选过程中刺激细胞而使其活化；而美天旎的磁珠只有50nm，这种体积小的磁珠需要通过分选柱放大磁场1000到10000倍进行分选（miltenyi磁性分选器是特制的，可以满足磁场放大的需求），这样即可以具有很好的细胞分选效果，又可以减少对细胞的损害，更重要的是美天旎这种小体积的磁珠不会活化细胞，对下游实验不会产生影响。
6、 MACS相比FACS的优点：
1. 适合大批量的细胞分选，FACS分选速度相对而言要慢很多；
2.稳定性高，重复性强，而FACS由于机器运行时间长会导致参数漂移故而实际获取得靶细胞阳性率会大大下降；
3.无须大型设备，普遍适合大多数实验室的细胞分选工作；
4.操作简单，无须专门的设备操作人员（FACS操作需要一定的经验）。
7、 磁珠分选细胞注意事项：
1.待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度；
2.抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。因而分选前去除死细胞；
3.新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。
4.上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块；
5.用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞；
6.细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，避免将细悬液沿管壁流入，使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，*后导致纯度不高。洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。
7.分选细胞量应根据说明书控制，不超量；
8.孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合；
9.先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合；