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采用体外细胞暴露技术建立化学品呼吸道过敏反应的人肺体外模型
简介
化学品引起的呼吸道过敏反应，不论是体内还是体外，目前尚缺少有效的评价方法。因此，新实验方法的开发收到极大的关注，特别是考虑到REACH（《化学品注册、评估、许可和限制》）新的法规规定。应注意的是，REACH指导方针明确指出，应尽量避免动物实验，其中，化妆品材料应在2013年**禁止动物实验。所以，建立体外模型显得非常必须和十分的紧迫。
为了化学品呼吸道过敏反应的人肺体外模型的建立，我们开发一种三维共培养系统，模拟人肺肺泡区。该系统，采用气液界面暴露技术，使体外培养的细胞在完全模拟人肺部环境下暴露于气溶胶或颗粒物质。
方法
建立三种类型的共培养系统：
双细胞共培养模型：
•人肺上皮细胞（ECs）：A549细胞
•人肺泡巨噬细胞（AMs）：U937细胞
三细胞共培养模型，类型1和类型2：
• ECs: A549 cells
• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA
• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes
ECs种在BD细胞培养插件上，培养7天。形成上皮细胞层后，AMs种在ECs层上。对于三细胞共培养类型1，DCs培养在细胞培养插件上（如图1A）；对于三细胞共培养类型2，DC细胞种在上皮层内侧（如图1B）。
 
      
细胞培养的终点特征：
• EC层完整性：用Millicel-ERS (Millipore)测量跨上皮电阻（TEER）。
• EC层功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。
• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86
使用体外暴露染毒系统（如图1C,D）的共培养模型对呼吸敏化剂和刺激物进行暴露染毒实验。
结果
 TEER测量：电阻值随着时间增加。*高值出现在第7天（红色箭头），此时对插件进行处理（图.2）。
图 2:  每个值是3个腔室内测量的标准偏差平均值。
Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C产物，用**化学染色方法所示（图.3A）。作为阴性对照，AMs没有染色阳性proSP-C (图. 3B)。使用**化学染色方法（图.3C）和流式方法（图.3D）分析未成熟的DCs。两种方法表明，培养的DC具有CD86/CD83阴性表达。流式表明DC-marker CD1a细胞呈阳性（图.3D）。
  
图3：**细胞化学（A-C）和流式（D）的表面标记。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（蓝色信号）和抗-proSP-C（红色）。在ECs上检测到ProSP-C，但是在AMs上检测不到。C：DCs DAPI染色（蓝色信号）和CD86（红色）。大部分细胞CD86呈阴性（箭头）。 D：DCs流式分析。
讨论
以上是采用体外细胞暴露技术建立化学品呼吸道过敏反应的人肺体外模型。这种复杂三维细胞共培养体统的使用，我们能够鉴定生物标记物的呼吸道过敏反应。由于体外暴露技术可以直接使用粉末状颗粒物，不必要求必须具有水溶性特征，所以这一方法可扩展适用各种化学品。

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